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Nueva estrategia para la identificación de Detección de Escherichia coli y coliformes por PCR multiplex

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La presencia de bacterias coliformes se evalúa rutinariamente para establecer la seguridad microbiológica de los suministros de agua y alimentos crudos o procesados. Coliformes son un grupo de lactosa-fermentada de Enterobacteriaceae, que muy probablemente adquirió el gen lacZ por transferencia horizontal y por lo tanto constituyen un grupo polifilético.Entre este grupo de bacterias es Escherichia coli, el patógeno que está asociado más frecuentemente con los brotes de enfermedades transmitidas por los alimentos y a menudo se identifica mediante la actividad enzimática β-glucuronidasa o por la detección redundante de uidA mediante PCR.

Una amplia variedad de agentes patógenos transmitidos por los alimentos a base de agua y están presentes en concentraciones muy bajas y por tanto son difíciles de detectar. Mientras que los coliformes, en particular Escherichia coli, rara vez causan enfermedad, estas bacterias son abundantes en humanos y en heces de animales por lo tanto se utilizan regularmente como indicadores microbianos de la contaminación enteropatógenas en los suministros de agua y alimentos.

El grupo coliforme fue vagamente definido desde su creación, sobre todo por la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa, y carece de valor taxonómico. Las bacterias coliformes se distribuyen entre diversos géneros y diferentes autores utilizan diferentes criterios de inclusión. Sin embargo, los coliformes se describen generalmente como, ácido y gas en forma de varilla Enterobacteriaceae que fermentan la lactosa produciendo gram-negativa.

La posesión del gen lacZ, que codifica para la β-galactosidasa, es la característica más prominente de los coliformes, mientras que β-D-glucuronidasa, codificada por el gen uidA, se utiliza rutinariamente para identificar específicamente E. coli

Históricamente, la definición de coliformes se ha basado principalmente en las técnicas utilizadas para su detección. Métodos de detección tradicionales se basan en el cultivo de las muestras en medios selectivos y condiciones de incubación específicas. Este enfoque permite la enumeración de células pero es engorroso, lento y no consigue marcar células bacterianas viables pero no cultivables (VBNC).

E coli 2

En la formación de gas enterobacterias de la lactosa depende de hydrogenlyase fórmico y fácilmente inhibido. Así, la detección de coliformes por la producción de gas carece de importancia. Este método también carece de especificidad, como Aeromonas spp. también puede fermentar la lactosa. Además, tanto β-galactosidasa y β-D-glucuronidasa son enzimas inducibles y su actividad se ve afectada por la temperatura de incubación y el medio de crecimiento. En consecuencia, ambas bacterias falsos positivos y falsos negativos interfieren con la evaluación.

Varias pruebas comerciales actuales implican ensayos enzimáticos específicos que utilizan sustratos cromogénicos o fluorogénicos para la detección mejorada de coliformes. Estos métodos son simples y rápidos, pero su especificidad se ve comprometida. 

En el trabajo realizado por  el Departamento de Bioquímica, Biología Molecular y Genética de la Universidad de España, se presenta una nueva estrategia para la identificación bacteriana diferencial por PCR multiplex.

El objetivo era combinar, en un solo ensayo, de amplio rango y la detección de alta especificidad de ambas coliformes totales y E. coli, respectivamente. Para superar la variabilidad de secuencias lacZ, conjuntos de cebadores fueron dirigidos a la secuencia de consenso de una alineación. Un gen huérfano, yaiO, fue seleccionado como el objetivo para la identificación específica de E. coli. Los amplicones resultantes, tanto in silico e in vitro, indican que estas sondas son más eficientes que los descritos anteriormente.

Dos estrategias se utilizaron para diseñar cebadores de oligonucleótidos con diferentes niveles de especificidad para la detección simultánea de coliformes totales y E. coli mediante PCR multiplex. Una secuencia consenso de lacZ y el yaiO gen huérfano fueron elegidos como objetivos para la amplificación, produciendo 234 pb y 115 pb productos de PCR, respectivamente.

Conclusiones
La transferencia horizontal de genes implica la alta capacidad de evolución de los genomas bacterianos, pero dificulta la detección específica de indicadores tales como coliformes. Sin embargo, cuando la industria alimentaria implica la actividad bacteriana compleja, como la producción de queso, la exactitud de la detección bacteriana es crucial.

La amplificación de secuencias de ADN por PCR permite la detección de células no cultivables o muertas. Los cebadores diseñados en este trabajo, se dirigen a una región conservada de lacZ y el yaiO gen huérfano, los cuales demostraron la capacidad de detección superior cuando se probó con la colección de laboratorio donde las cepas fermentan la lactosa aisladas en las muestras de leche.

Por Felipe Molina fmolina@unex.es

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